I FATTORI DI DIFFERENZIAZIONE
Un’Informazione intelligente origina la vita: sono i fattori presenti nei 5 stadi di differenziazione delle cellule staminali che determinano il destino delle cellule sane e patologiche.
Questi sono i risultati prodotti con la collaborazione di 23 università italiane sulle nuove frontiere per la riprogrammazione cellulare per determinare il destino delle cellule staminali sane e patologiche.
In un articolo pubblicato nel 1988 su Cancer Letter da Pier Mario Biava e collaboratori dell’Istituto di Medicina del Lavoro dell’Università di Trieste insieme a ricercatori dell’Istituto Nazionale dei Tumori di Milano veniva fin dalle premesse descritto come il lavoro, che veniva presentato, partiva dall’ipotesi che i tumori fossero patologie reversibili, sulla base di osservazioni scientifiche che dimostravano come fattori del microambiente embrionario fossero in grado di riprogrammare le cellule tumorali, riconducendole ad un comportamento normale. Dopo quel primo lavoro gli studi di Biava sono continuati nel tempo con la collaborazione di diversi Istituti Universitari: l’Università La Sapienza di Roma, l’Università di Pisa e l’Università di Bologna, oltre che con Università straniere ( Biava ha pubblicato articoli con il Prof. Janis Klavins della Cornell University di New York, con il Prof. Richard Ablijn, scopritore del PSA, il primo marker descritto nel tumore della prostata, con Stewart Sell che ha studiato in modo approfondito la biologia delle staminali del fegato ecc.). Queste ricerche sono state portate avanti per un periodo abbastanza lungo senza suscitare interesse nella comunità scientifica, in quanto la maggior parte dei ricercatori e degli oncologi rivolgevano la loro attenzione e le loro ricerche nel mappare il DNA e individuare i singoli geni che potevano essere importanti come cause dei tumori. Nel frattempo però le ricerche di Biava e collaboratori in un arco sufficiente lungo di tempo avevano permesso di individuare i vari meccanismi molecolari con cui i fattori di differenziazione delle cellule staminali normali, prelevati dall’embrione di Zebrafish (era stato scelto detto embrione perchè esso è il modello più studiato del differenziamento embrionario) fossero in grado di differenziare o di condurre alla morte cellulare programmata le cellule tumorali. Non solo, ma erano state individuate da quali sostanze fossero costituiti tali fattori ed erano state identificate, con gas cromatografia- spettrometria di massa, le singole molecole che entravano nella composizione dei diversi networks differenziativi. Così è iniziata la riprogrammazione cellulare.
I primi esperimenti sono stati pubblicati su Cancer Letter nel 1988
Poi tante altre pubblicazioni, e nel 2015…
Ci vollero quasi 20 anni per dare corpo a queste osservazioni finchè Nature, una delle più prestigiose riviste scientifiche al mondo, nel 2007 pubblicò un articolo dove veniva dimostrato come le cellule tumorali si comportino in maniera molto simile alle cellule staminali e nello specifico furono studiate quelle dello zebrafish. Questa similitudine tra cellule tumorali e staminali è molto forte al punto che sulle cellule tumorali si attivano dei recettori che rispondono alle stesse proteine che agiscono sulle cellule staminali embrionali e che hanno il compito di trasformare l’iniziale massa informe delle cellule embrionali nei differenti tessuti che costituiscono il corpo del nascituro. Stiamo parlando dei fattori di differenziazione, cioè dei peptidi fondamentali per lo sviluppo della vita. (Nature).
Emerge quindi una tesi molto interessante: una cellula tumorale è una cellula che torna verso il suo stato arcaico, quando cioè era staminale e si comporta come tale. Il suo sviluppo però ora non è più nel microambiente embrionale, dove sono presenti tutte le sostanze che ne controllano e coordinano la crescita in modo fisiologico. Sviluppandosi in organi maturi dei soggetti che si sono ammalati, perché i loro controllori embrionali sono molto minori, il tumore si sviluppa senza freni.
Infatti se impiantiamo cellule tumorali umane nell’embrione di zebrafish, quando sono abbondanti i fattori di differenziazione, queste cellule tumorali vengono differenziate e modificate in cellule normali. Impiantandole invece dopo l’organogenesi, quando sono diminuiti i fattori di differenziazione, crescono e riproducono il tumore. (Current Pharmaceutical Biotechnology)
Questo concetto spiega perché si è sviluppata negli ultimi anni una grande quantità di osservazioni ed esperimenti fatti in più parti del mondo. Uno studio canadese ad esempio ha osservato sia in vitro che in vivo come i fattori di differenziazione staminale siano in grado di indurre l’apoptosi nelle cellule tumorali. Per i non addetti ai lavori l’apoptosi è il suicidio programmato delle cellule malate. (Anticancer Research).
A riprova di questo fatto si è constatato che cellule di melanomi umani maligni trapiantate in embrioni di zebrafish nella prima fase dello sviluppo pur avendo confermato il loro atteggiamento metastatico effettuando una migrazione nei vari tessuti, non hanno sviluppato il tumore. (Developmental analysis)
Si sono attivati in numerosi laboratori ed ospedali internazionali degli studi per verificare questa tesi e ricercare un modo per offrire una valida risposta ai malati di tumore integrando quei fattori embrionali carenti nei soggetti che si sono ammalati.
Numerosi studi in vitro, su animale e sull’uomo stanno dimostrando che la tesi è valida e le principali ricerche si sono concentrate sul tumore al fegato, al colon, alla prostata, al rene, al seno e poi sono stati studiati anche il glioblastoma, il melanoma, l’adenocarcinoma e leucemia linfoblastica. (Journal of Tumor Marker Oncology)
Similmente testando i fattori dello zebrafish su cellule di tumore del colon CaCo2 si è notato il blocco della proliferazione tumorale e l’induzione dell’apoptosi. (Apoptosis)
Prende sempre più corpo la consapevolezza che la presenza di fattori delle staminali embrionali protegga dallo sviluppo dei tumori mentre la carenza permetta alle cellule tumorali di svilupparsi.
EFFICACIA SULLA BASE DEGLI STUDI CLINICI
Due studi clinici sono stati realizzati per verificare prima la sicurezza e poi l’efficacia dell’integrazione con i fattori di differenziazione staminale dei trattamenti chemioterapici standard.
Un primo studio è stato effettuato su 200 pazienti, inclusi 60 con tumore al seno in stadio avanzato, È stato successivamente realizzato uno studio clinico randomizzato su 179 pazienti affetti da un epatocarcinoma di stadio intermedio o avanzato. I risultati hanno evidenziato una differenza statisticamente significativa tra il gruppo trattato con la sinergia di fattori di differenziazione e trattamenti standard.
Ammalatosi di cancro al cervello, Salvatore decide di ribellarsi al codice della malattia. E scrive: La Cura. Per saperne di più: http://la-cura.it/
Trattamento integrativo in oncologia: i fattori di differenziazione cellulare come integrazione alla chemioterapia
Documento approvato
al congresso organizzato dalla Società Italiana di Oncologia Medica
Un Nuovo paradigma in Medicina
È importante notare che la ricerca sulla possibilità di riprogrammare le cellule staminali del cancro richiede un approccio complesso alla questione. Infatti, la soluzione del problema richiede lo studio delle reti di sostanze e dei geni coinvolti nella fase di riprogrammazione, e quindi delle competenze in diversi settori di ricerca, non semplicemente medico / biologico, ma anche matematico – computazionali, in considerazione della complessità e della non linearità dei processi studiati.
Ciò significa cambiare il paradigma scientifico e spostare dal riduzionismo che studia solo molecole singole o singolo meccanismo alla complessità, come descritto nell’articolo sul nuovo paradigma della medicina.
Il futuro vedrà il nostro impegno nel crescente numero di studi scientifici che richiedono una visione complessa della vita.
Una delle scoperte più importanti fatte all’inizio di questo secolo è quella relativa al Codice Epigenetico, un codice che in realtà il Dr. Biava ha iniziato a studiare proprio partendo dallo studio della regolazione dell’espressione genica legata al trattamento con i fattori di differenziazione staminali. Detti fattori infatti sono in grado di attivare o disattivare molteplici geni e di correggere le alterazioni genetiche ad esempio indotte dalle sostanze cancerogene. Funzionano pertanto come dei regolatori epigenetici dell’espressione genica.
Embrioni di Zebrafish
Parallelamente al sequenziamento del codice genetico è emerso un altro ambito di ricerca, quello dell’epigenetica. Si parla pertanto di due tipi di codice, quello genetico e quello epigenetico che sta sopra al codice genetico e ne regola il funzionamento. Nell’ambito degli approcci epigenetici in campo oncologico si è consolidata da diversi anni la ricerca sulla riprogrammazione delle cellule staminali tumorali con i fattori di differenziazione embrionale.
Di fatto si è dimostrato che i fattori di differenziazione delle cellule staminali prelevati dall’uovo di Zebrafish, che ha oltre il 90% di proteine in comune con quelle umane, sono in grado di normalizzare il ciclo cellulare delle cellule cancerose. Si tratta degli stessi meccanismi che in natura sono attivi durante le fasi di organogenesi, quando cioè avvengono tutti i processi di differenziazione delle cellule staminali che portano alla formazione di tessuti ed organi. In queste fasi, dove è molto alto il rischio di sviluppare errori nella replicazione, i fattori di differenziazione hanno anche un importante ruolo correttivo verso quelle cellule che vanno incontro ad errori. La riconferma di questo meccanismo si è avuta quando, impiantando cellule tumorali in un embrione durante la fase di organogenesi sono stati osservati processi differenziativi ed apoptotici sulle cellule tumorali impiantate; al contrario impiantando cellule tumorali in un embrione dopo la fase di organogenesi le cellule tumorali hanno proseguito a proliferare. Si può pertanto parlare di “riprogrammazione” epigenetica delle cellule malate attraverso l’integrazione di quei peptidi che sono in grado di riportare la cellula nell’ambito della sua normale fisiologia.
Queste ricerche, iniziate già nella fine degli anni ‘80, sono state sviluppate dal Children Hospital di Chicago, dalla Northwestern University, dall’Università La Sapienza di Roma, ecc.
Emerge che i fattori di differenziazione sono in grado, in associazione con i trattamenti chemioterapici standard, di rallentare e spesso bloccare il ciclo cellulare delle cellule tumorali, sia attivando il gene onco-repressore p53, sia regolando in modo post-traduzionale la proteina del retino blastoma (pRb) che ha anch’essa un’attività di blocco del ciclo cellulare. Contestualmente vengono attivate dagli stessi fattori di differenziazione anche una serie di cascate di geni regolatori che tentano di riparare i danni cellulari all’origine della malignità: se le alterazioni non sono troppo gravi queste vengono effettivamente riparate; se invece le mutazioni sono troppo gravi e non sono riparabili vengono attivati i geni della morte cellulare programmata/apoptosi e le cellule cancerose muoiono. Di fatto dopo il trattamento con i fattori di differenziazione delle cellule staminali le cellule tumorali escono dal ciclo della moltiplicazione cellulare.
Sono già state realizzate una serie di ricerche importanti sulla sinergia fra agenti chemioterapici e fattori di differenziazione, nel 2011 ad esempio è stata pubblicata su Current Pharmaceutical Biotechnology una ricerca condotta presso l’Università La Sapienza di Roma dove si è osservato in vitro il rallentamento della crescita di cellule del tumore del colon CaCo2 : un rallentamento del 35% si è ottenuto con il trattamento col solo 5 Fluoro-Uracile, un rallentamento del 98% è invece stato ottenuto con la contemporanea somministrazione di 5 Fluoro-Uracile e fattori di differenziazione.
Lo stesso Richard Ablin (scopritore del PSA) ha riportato in un articolo pubblicato nel 2014 un effetto notevolmente benefico della sinergia fra fattori di differenziazione e ablazione chirurgica o altri trattamenti tradizionali del tumore della prostata. I fattori di differenziazione staminale hanno dimostrato infine di migliorare il performace staus e la qualità della vita nell’82% dei pazienti trattati e di ridurre gli effetti collaterali avversi della chemioterapia.
Di seguito vengono illustrate le principali immagini legate ai diversi studi realizzati sui fattori di differenziazione embrionale:
Lo stato dell’arte della ricerca comprende sia lavori in vitro sulle dinamiche molecolari in cui sono implicati i fattori di differenziazione staminale, sia lavori in vivo: su topi e su uomini. Resta necessario implementare la ricerca in vivo, specialmente clinica.
Nello specifico sono stati realizzati studi sui seguenti aspetti:
- Azione di rallentamento e/o blocco del ciclo cellulare
- Attivazione p53
- Regolazione post traduzionale pRb
- Rallentamento della crescita di linee cellulari tumorali
- Studi su animali
- Analisi proteica dell’estratto di uova di zebrafish
- Studio clinico su 200 pazienti per la valutazione di possibili effetti collaterali
- Studio clinico randomizzato su 179 pazienti affetti da epatocarcinoma di stadio intermedio o avanzato
Azione di rallentamento e/o blocco del ciclo cellulare
Si è potuto dimostrare che nel microambiente embrionale sono presenti fattori che regolano l’espressione dell’oncorepressore p53, attivandolo, ed in modo post traduzionale pRb. Trattando infatti con i fattori di differenziazione staminale cellule di diverse linee tumorali si è osservato un blocco del ciclo cellulare nella fase G1-S.
Attivazione p53
Attraverso citofluorometria ed immunoistochimica si è evidenziato un significativo incremento nella concentrazione della proteine p53, in linee specifiche linee cellulari tumorali quali il glioblastoma multiforme, il melanoma e l’epatocarcinoma trattate con i fattori di differenziazione staminale. Tale incremento è conseguenza delle regolazione trascrizionale del gene oncosoppressore p53.
Prima:
Dopo:
Regolazione post traduzionale della proteina del retino blastoma (pRb)
Trattando linee cellulari tumorali come quelle dell’adenocarcinoma del rene è stata osservata una regolazione post traduzionale della proteina del retinoblastoma (pRb), nota per la sua funzione di blocco del ciclo cellulare; questa regolazione comporta modificazioni del rapporto tra la forma fosforilata e la forma non fosforilata della proteina pRb in favore della forma non fosforilata. Questa forma blocca il ciclo cellulare ostacolando la trascrizione del gene E2F-1.
Biava, P.M.; Bonsignorio, D.; Hoxa, M.; Facco, R.; Ielapi, T.; Frati, L.; Bizzarri, M. Post-traslational modification of the retino-blastoma protein (pRb) induced by in vitro administration of Ze- brafish embryonic extracts on human kidney adenocarcinomacell line. J. Tumor Marker Oncol., 2002, 17, 59-64
Rallentamento della crescita di linee cellulari tumorali
Questi meccanismi di blocco del ciclo cellulare sono stati osservati in diverse linee cellulari tumorali.
Nello specifico sono state studiate linee cellulari tumorali di:
- Glioblastoma
- Melanoma
- Tumore al seno
- Leucemia Linfoblastica
- Adenocarcinoma del rene
Glioblastoma:
Melanoma:
Tumore al seno:
Leucemia linfoblastica:
Adenocarcinoma del rene:
EFFETTO SINERGIZZANTE CON LA CHEMIOTERAPIA
Per verificare l’effetto sinergico tra chemioterapia e fattori di differenziazione sono state trattate linee cellulari di tumore al Colon CaCo2 con:
- 5-FLUOROURACILE
- FATTORI DI DIFFERENZIAZIONE
- 5-FLUOROURACILE + FATTORI DI DIFFERENZIAZIONE
COME SI EVINCE DAI GRAFICI EMERGE UNA POTENTE ATTIVITÀ SINERGIZZANTE NELL’ASSOCIAZIONE DEI FATTORI DI DIFFERENZIAZIONE CON IL 5-FLUOROURACILE.
Studi su animali:
Gli effetti dei fattori di differenziazione staminale sull’inibizione della crescita dei tumori sono stati testati in vivo su femmine di topi singenici C57BL/6 dal peso di 18 – 20 gr a cui veniva effettuata un’iniezione sub cutanea di carcinoma primario del polmone di Lewis.
Sono quindi state valutate sia le dimensioni, a vari giorni, del tumore primario, sa il tempo di sopravvivenza dei topi. In termini di sviluppo del tumore primario si è osservata una differenza estremamente significativa (P<0.001) tra i topi trattati e quelli di controllo (figura 1) e così anche per quanto riguarda il rapporto di sopravvivenza, sempre in favore del topo trattato.
Biava, P.M.; Bonsignorio, D.; Hoxha, M.; Impagliazzo, M.; Frosi, A.; Larese, F.; Negro, C. (2002) Mother-embryo cross-talk: the anti-cancer substances produced by mother and embryo during cell differentiation. A review of experimental data. J. Tumor Marker Oncol., 2002, 17, 55-58
Analisi proteica dell’estratto di uova di Zebrafish,
E’ stata realizzata un’analisi proteica dell’estratto embrionale dalle uova di zebrafish. Una sospensione dell’estratto in soluzione glicero – alcolica è stata analizzata con gel elettroforesi monodimensionale (SDS-PAGE). Come mostrato nella figura sottostante in tutte e 5 le fasi estratte sono distinguibili in base al loro peso molecolare tre principali raggruppamenti: sopra i 45 kDa, intorno ai 25 – 35 kDa e sotto i 20 kDa. In ogni modo la relative quantità di proteine sono differenti nei campioni delle 5 fasi.
Di seguito la lista delle proteine che sono state individuate da Biava e coll. con l’analisi di spettrometria di massa. Con l’asterisco (*) sono elencate le proteine mai prima descritte nell’embrione di Zebrafish:
Studi Clinici
Due studi clinici sono stati realizzati per verificare prima la sicurezza e poi l’efficacia dell’integrazione con i fattori di differenziazione staminale dei trattamenti chemioterapici standard.
Un primo studio è stato effettuato su 200 pazienti, inclusi 60 con tumore al seno in stadio avanzato, per valutare i possibili effetti collaterali: per questa ragione nello studio non è stato previsto un gruppo di controllo.
Il protocollo prevedeva la somministrazione ai pazienti di 1 ml per 3 volte al giorno di soluzione sottoforma di gocce sublinguali contenente i fattori di differenziazione staminale in bassa concentrazione (3 microgrammi/ml). Dopo 3 anni di trattamento non si sono stati registrati affetti avversi in nessuno dei 200 pazienti trattati; in aggiunta l’80% di questi pazienti ha evidenziato un miglioramento del performance status, valutato con la scala E.C.O.G.: generalmente lo stato di performance status si spostava da uno stato di 4 o 3 ad uno di 2 o 1.
Nei 60 pazienti di tumore al seno inoltre si sono registrati 4 casi di parziale regressione ed il 70% di sopravvivenza dopo 3 anni.
Ecco il link dello studio pubblicato: Tumor-Marker-Oncology.pdf
Biava, P.M.; Bonsignorio, D.; Impagliazzo, M.; Frosi, A.; Larese, F.; Negro, C.; Hermann, G.F.; Matarese, S.; Malzac, J.; Pontiggia, P. Embryonic differentiation factors with anticancer properties: preliminary clinical results in the therapy for advanced tumors. J. Tumor Marker Oncol., 2002, 17(3), 65-69
E’ stato successivamente realizzato uno studio clinico randomizzato su 179 pazienti affetti da un epatocarcinoma di stadio intermedio o avanzato. I risultati hanno evidenziato una differenza statisticamente significativa tra il gruppo trattato con la sinergia di fattori di differenziazione e trattamenti standard ed il gruppo di controllo (P=0.03), differenza in favore del gruppo trattato con l’integrazione.
Si sono registrate il 19,8% di regressioni (2,5% delle quali regressioni totali) ed il 16% di stabilizzazione della malattia.
Ecco il link dello studio pubblicato su PubMed: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16491958/
Livraghi, T.; Meloni, F.; Frosi, A.; Lazzaroni, S.; Bizzarri, M.; Frati, L.; Biava, P.M. Treatment with stem cell differentiation stage factors of intermediate-advanced hepatocellular carcinoma: an open randomized clinical trial. Oncol. Res., 2005, 15, 399-408
La posizione degli Oncologi:
Si riporta qui di seguito il documento scritto dai membri del “Comitato Scientifico” costituito da Professori Universitari di Oncologia, Farmacologia, Chirurgia per valutare i lavori pubblicati dal Dr. Biava in Riviste Scientifiche Internazionali e per consigliare quindi la classe medica ed i pazienti in merito ai possibili trattamenti con i fattori di differenziazione studiati dal Dr. Biava. Tale documento, definito “POSITION PAPER”, presentato al Convegno Nazionale organizzato dalla Società di Oncologia Medica ( SIMO) tenutosi a Milano nel giugno 2017, è stato approvato dagli oncologi della SIMO: in tale documento si afferma che i trattamenti proposti dal Dr. Biava possono potenziare le terapie tradizionali di consolidata efficacia attuate dagli oncologi, diminuendone nel frattempo gli effetti collaterali. Le conclusioni degli oncologi sono quindi le seguenti:
La posizione dell’ordine dei Biologi:
Riportiamo qui l’articolo recentemente Pubblicato ne “ Il Giornale dei Biologi” N 7 Novembre/Dicembre 2018 che riassume in modo ampio le ricerche ed i risultati ottenuti dal Dr. Biava dopo numerosi anni di ricerche. “Il Giornale dei Biologi” è il mensile dell’Ordine dei Biologi e quindi il giornale ufficiale dell’Ordine dei Biologi Italiani.
La presentazione fatta dal Dott. Biava
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